La chiesa di Sant'Anna è strettamente legata ai palafrenieri, gentiluomini di corte con mansioni di fiducia. La santa è sempre stata venerata come loro protettrice, tanto che nel 1378, quando venne eretta la confraternita, fu scelta come patrona.
A quei tempi, i palafrenieri erano soliti pregare all'altare eretto da Urbano VI in San Pietro. Fu così fino al 1565, quando venne decisa la costruzione dell'attuale chiesa. Il progetto fu affidato all'architetto Giacomo Barozzi, detto Vignola. Tra il 1577 e il 1581 i lavori vennero sospesi a causa di problemi economici della confraternita, ma negli anni successivi si riuscì a portare a termine la costruzione e nel 1583 venne inaugurata.
Il 30 maggio 1929, con la Costituzione apostolica Ex Lateranensi pacto, Pio XI istituiva la Pontificia Parrocchia di Sant'Anna in Vaticano. Gli agostiniani erano presenti a Castel Gandolfo nella chiesa di san Tommaso da Villanova: Pio XI volle che venisse fatto uno scambio, e così la chiesa di san Tommaso a Castel Gandolfo venne invece affidata ai salesiani e invece gli agostiniani vennero in Sant'Anna. Il primo parroco fu padre Agostino Ruelli, nominato il 7 agosto 1929. Il 18 agosto successivo iniziava il servizio ministeriale dei figli di Sant'Agostino nella parrocchia, che continua fino ai nostri giorni.
Elenco dei parroci:
P. Agostino Ruelli, parroco dal 1929 al 1931
P. Nicola Fattorini, parroco dal 1931 al 1961
P. Davide Falcioni, parroco dal 1961 al 1991
P. Gioele Schiavella, parroco dal 1991 al 2006
P. Bruno Silvestrini, parroco dal 2006 al 2019
P. Mario Millardi, parroco in carica dal 2019