I palafrenieri (o parafrenieri), dei quali abbiamo menzione nel nome stesso della chiesa, in origine erano gentiluomini di corte con mansioni di fiducia nell'ambito di compiti di minore importanza. Il loro ruolo potrebbe essere paragonato a quello dello scudiero nella corte imperiale o regia. Naturalmente, il prestigio e l'autorità dei palafrenieri erano direttamente proporzionali all'importanza militare e politica, nonché morale, della corte presso cui prestavano la loro opera.
Fino alla metà del sec. XVI i palafrenieri pontifici si trovavano ad occupare una posizione di prestigio sempre maggiore, cumulando titoli e privilegi. Innocenzo VIII nel 1487 concesse ai cardinali la facoltà di assegnare ai loro palafrenieri due benefici e due canonicati in qualsiasi chiesa. Tra il 1523 e il 1533 Clemente VII prescrisse che i palafrenieri della corte pontificia fossero anteposti ai conclavisti e conferì loro le dignità di "notaro, conte palatino, nobile"; inoltre essi poterono "crear dottori in teologia e legge, baccellieri, licenziati". Tali benefici e privilegi vennero riconfermati dal Papa Giulio III fra il 1550 ed il 1555. Con le norme e i decreti emanati dal Concilio di Trento, conclusosi nel 1563, riguardanti i benefici ecclesiastici, i palafrenieri andarono rapidamente perdendo molti privilegi e subirono perdite anche di carattere economico; tra l'altro videro svanire anche la somma di settanta scudi che ogni cardinale, in occasione dell'elezione, versava alla confraternita.
In seguito a tali eventi sfavorevoli le file della fratellanza, come viene anche definita "la confraternita" in documenti del tempo, si andarono assottigliando e perciò, accanto ai nobili palafrenieri del Papa e dei cardinali, vennero aggiunti nel 1613 i palafrenieri degli ambasciatori di Francia, Spagna, Venezia e dell'Impero di Germania; nel 1667 vennero ammessi quelli del Governatore di Roma, nel 1696 quelli dei prelati con l'uso dei fiocchi (Uditore di Camera e Tesoriere), del Senatore di Roma e dei maggiordomi del Papa discendenti da famiglia principesca. Nel 1702, infine, furono annoverati tra i confratelli anche i palafrenieri dei principi e nel 1748 la confraternita aprì le porte anche a servitori dei prelati e della nobiltà romana. Con quest'ultimo provvedimento fu radicalmente mutata la natura stessa della confraternita, che perse il suo carattere di associazione con finalità di culto. Non essendo più formata da esponenti della nobiltà europea, assunse una connotazione popolare, affiancando all'originario scopo culturale un'azione di beneficenza a favore delle famiglie dei confratelli in difficoltà.
La confraternita, successivamente arciconfraternita, si costituì legalmente nel 1378, ma diverse fonti rivelano che i palafrenieri già in tempi precedenti erano soliti riunirsi in occasione di cerimonie di culto in onore di S. Anna, che è sempre stata la loro protettrice. Nel contempo è possibile seguire il variare dei luoghi in cui il culto era celebrato.
La chiesa di S. Anna in Marmorata, ovvero S. Maria in Aventini radicibus, detta "una volta dei palafrenieri del Papa e dei cardinali", è stata da essi fondata tra il 1216 ed il 1287, sotto il pontificato di Onorio III ed Onorio IV. Durante il periodo di residenza dei Papi al Quirinale i palafrenieri si riunivano in S. Anna alle Quattro Fontane; altra chiesa cui facevano riferimento era S. Gregorio al Celio, dove un sacerdote era regolarmente incaricato della celebrazione di Messe in suffragio dei palafrenieri defunti. Sotto il Papa Nicolò III, nella seconda metà del sec. XIII, la residenza papale venne definitivamente spostata dal Laterano al Vaticano, ed è naturale pensare che il trasferimento abbia interessato anche i palafrenieri, e che, di conseguenza, questi abbiano cominciato a celebrare le cerimonie di culto nell'ambito dei palazzi vaticani. Durante il papato di Urbano VI, nel 1378, i palafrenieri si costituirono in confraternita e cominciarono a riunirsi intorno all'altare di S. Anna eretto da questo Papa in S. Pietro. Ma questo altare non fu l'ultima sede per l'espressione della devozione dei palafrenieri.
