Nel giugno 1565 si scelse il luogo di costruzione della chiesa che vediamo tuttora ed a novembre dello stesso anno iniziarono i lavori. L'autore del progetto fu l'architetto Giacomo Barozzi, detto Vignola, uno dei nomi più illustri dell'architettura rinascimentale, la cui impronta stilistica ha continuato a caratterizzare la facciata principale e la pianta della chiesa, nonostante i cambiamenti ed i restauri effettuati nel corso del tempo.
La copertura era del tutto diversa dall'attuale, ma purtroppo dei disegni del progetto non rimangono tracce ed, inoltre, sono andate perdute le undici medaglie destinate ai cardinali, coniate per commemorare l'evento, sulle quali figurava il nuovo edificio, secondo un uso già seguito nel mondo romano e vivo fino ai giorni nostri. Quanto resta è un' incisione del 1615, da cui si vede che il tetto era a doppio spiovente, con il campanile a vela, e le campane sistemate su ordini sovrapposti. La facciata non è perfettamente visibile, ma i documenti contabili della confraternita, da cui si possono trarre le notizie più minuziose circa l'entità delle spese sostenute per la costruzione ed i nomi di quanti ebbero incombenze a tutti i livelli, testimoniano che essa già nel progetto originario presentava quegli elementi architettonici, mantenuti anche in seguito, che furono un tema molto amato dal Vignola.
Nella concezione vignolesca la superficie della facciata non si presenta come una massa uniforme e lineare, ma, seguendo il gusto rinascimentale per i piani mossi ed i giochi di luci ed ombre, si articola su un piano di fondo scandito da cinque specchiature, di cui la centrale è fiancheggiata da colonne poggianti su basamenti distinti dalla zoccolatura di base e con capitelli dorici. Un richiamo ai canoni dell'architettura greca classica è riscontrabile nel leggero rigonfiamento (enthasis) presente a circa due terzi dell'altezza delle colonne; correzione ottica, questa, mirante ad eliminare l'impressione della convergenza dei profili laterali delle colonne. Sull'architrave corre l'iscrizione dedicatoria. Nella parte centrale della facciata si apre l'ingresso principale, evidenziato dalla minore ampiezza delle specchiature che lo fiancheggiano e dall'oggetto delle colonne più marcato di quello delle lesene che incorniciano le quattro zone laterali, divise ciascuna in tre registri sovrapposti, di cui quelli in basso e in alto presentano una semplice cornice quadrata, mentre quello centrale ha una nicchia vicino al portone ed una finestra in quelli esterni. Anche il frontone spezzato è tipico del gusto rinascimentale.
Tra il 1577 ed il 1581 i lavori vennero quasi sospesi a causa delle traversie di carattere sia economico che sociale affrontate dalla confraternita ed alle quali si è fatto cenno nel capitolo dedicato alla storia di questa associazione. Nel luglio 1583 la chiesa venne inaugurata, mentre ancora molte rifiniture dovevano essere portate a termine.
Dai documenti d'archivio dei palafrenieri si apprende che la copertura originaria era di travi di legno e, al di sopra, separato da un'intercapedine, vi era un rivestimento esterno di tegole, la cui descrizione corrisponde esattamente all'immagine che ci offre l'incisione già menzionata. All'esterno la pianta della chiesa è rettangolare (fig. 2), e l'edificio presenta anche sui muri laterali esterni la serie di nervature formate da lesene, le quali, oltre a costituire un elemento decorativo chiaroscurale, rappresentano un notevole fattore di rafforzamento della struttura muraria. Originariamente le finestre erano cinque, di cui quattro sono state eliminate nelle ristrutturazioni successive, e la quinta è ancora visibile, anche se murata, sul lato della chiesa prospiciente Via di Porta Angelica.
Sotto il pontificato di Clemente XI (1700-1721) la facciata fu oggetto dei primi rimaneggiamenti. L'architetto Alessandro Specchi ebbe l'incarico di progettare la balaustra ai lati del frontone (fig. 3) ed, alle sue estremità, i due campanili con cupola a cipolla (fig. 4) che sostituirono il campanile a vela, gli scultori Michael Maille e Francesco Moderati scolpirono gli angeli posti ai lati del frontone (fig. 5), che ben esprimono il gusto tardo barocco del tempo nei panneggi pesanti ed ampi, fortemente agitati dal vento, che forma pieghe profonde e larghe superfici di stoffa aderenti ai corpi, creando in tal modo forti contrasti di luci ed ombre. Sempre nello stesso momento venne praticata l'apertura del finestrone nella facciata e l'inserimento della cornice ovale che oggi contiene la raffigurazione di S. Anna e della Madonna (fig. 6).
Nel 1753 venne radicalmente mutata la struttura della copertura, terminata nel 1774 ad opera dell'architetto Francesco Navole, che rialzò l'edificio di circa m. 4,50 e nella nuova struttura muraria inserì otto finestroni, aumentando così notevolmente la luminosità all'interno. La copertura ebbe la forma a cupola che mantiene tuttora. I quattro vecchi finestroni vennero chiusi e nei loro vani furono collocati quattro dipinti raffiguranti episodi della vita di S. Anna, di cui si parlerà più avanti, nella trattazione dell'interno. Altri restauri furono eseguiti nel 1897 e nel 1931, solo a scopi conservativi, senza che in alcun modo venissero alterate le linee e le caratteristiche stilistiche già acquisite dalla facciata.
